Механизм свертывания крови

Механизм свертывания крови

Каждый поранившийся человек может наблюдать, как кровь превращается из жидкости в студенистую массу. Польза от этого процесса, называемого свертыванием крови, очевидна —прореха в стенке кровяного сосуда должна быть быстро и надежно перекрыта, чтобы предотвратить потерю крови.

Остановка кровотечения (гемостаз) происходит в результате взаимодействия эндотелия сосудов, особых клеток крови —тромбоцитов, которые склеиваются друг с другом, прикрепляются к месту повреждения и создают в месте ранения своего рода пробку, а также белков свертывания крови. Нарушения этой сложнейшей системы крайне опасны, поскольку приводят к кровотечению, тромбозу и другим серьезным патологиям. Человека могут поражать разные болезни (рак, инфаркт, инсульт, сепсис, атеросклероз и т.д.), а непосредственной причиной его смерти зачастую становится неспособность системы свертывания крови поддерживать баланс между жидким и твердым состояниями крови в организме.

Если причина известна, почему с ней нельзя бороться? Можно: в медицинской практике используются вещества, тормозящие свертывание крови (антикоагулянты) и даже растворяющие тромбы. Но беда в том, что их действие может привести к непредсказуемым результатам, поскольку неизвестно, какие именно нарушения произошли в системе. Новые методы диагностики и терапии создаются постоянно, но проблема в том, что управляется эта система очень сложным каскадом биохимических реакций.

А чтобы научиться регулировать их, нужно точно знать, куда приложить усилие. Простейшая аналогия: для взлета авиалайнера надо уверенно владеть его системой управления, и нелепо пытаться запустить его броском, как бумажный самолетик. Так и с системой свертывания: чтобы лечение было эффективным, надо точно знать, на какие «кнопки» нажимать.

Вплоть до самого последнего времени свертывание крови успешно сопротивлялось попыткам исследователей понять, как оно работает, и лишь недавно произошел качественный скачок. Но прежде чем рассказать о последних открытиях в понимании того, как функционирует эта система, кратко напомним, как она устроена и почему ее так сложно изучать.

Как устроена?
В основе гемостаза лежит тот же принцип, который используют домохозяйки для приготовлении холодца, —превращение жидкости в гель, коллоидную систему, где формируется сеть молекул, способная удержать в своих ячейках тысячекратно превосходящую ее по весу жидкость за счет водородных связей с молекулами воды. При свертывании крови происходит превращение растворимого белка фибриногена в фибрин, который затем полимеризуется в сетку. Эта реакция представляет собой единственную часть системы, имеющую физический смысл. Роль остального каскада бихимических реакций исключительно регуляторная, обеспечивающая это превращение в нужном месте и в нужное время.

Фибриноген напоминает стержень длиной 50 нм и толщиной 5 нм . Активация позволяет его молекулам склеиваться в фибриновую нить, а затем в волокно, способное ветвиться и образовывать трехмерную сеть.

Активатор фибриногена — тромбин — принадлежит к семейству сериновых протеиназ (ферментов, расщепляющих пептидные связи в белках). Он родственник пищеварительных ферментов трипсина и химотрипсина. Протеиназы синтезируются в неактивной форме, называемой зимогеном. Чтобы привести его в рабочее состояние, необходимо расщепить пептидную связь, удерживающую часть белка, которая закрывает активный центр. Так, тромбин вырабатывается в виде протромбина он обозначен как фактор II), который может быть активирован фактором X.

Запускает каскад биохимических реакций системы свертывания крови так называемый тканевый фактор —белок, присутствующий в мембранах клеток всех тканей, за исключением эндотелия и крови. В норме кровь остается жидкой только благодаря тому, что она защищена тонкой защитной оболочкой эндотелия. При любом нарушении целостности сосуда тканевый фактор связывает из плазмы фактор VIIa, а их комплекс активирует фактор X.

Тромбин также активирует факторы V, VIII, XI, что ведет к ускорению его собственного производства: фактор XIa запускает фактор IX, а факторы VIIIa и Va связывают факторы IXa и Xa, соответственно увеличивая их активность на порядки. Дефицит этих белков ведет к тяжелым нарушениям: так, отсутствие фактора VIII, IX или XI вызывает тяжелейшую болезнь гемофилию (знаменитую «царскую болезнь», которой страдал царевич Алексей Романов); а дефицит факторов X, VII, V или протромбина несовместим с жизнью.

В крови также присутствуют ингибиторы протеиназ системы свертывания. Основными из них считаются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора. Кроме этого, тромбин способен активировать сериновую протеиназу (протеин С), которая расщепляет факторы свертывания Va и VIIIa, заставляя их полностью терять свою активность.

Казалось бы, система свертывания изучена очень хорошо: уже 15 лет не открывали новых белков и реакций, что для современной биохимии составляет вечность. Конечно, нельзя исключить вероятность такого открытия, но пока мы не столкнулись ни с одним явлением, которое нельзя было бы объяснить с помощью имеющихся сведений. Скорее наоборот, система выглядит гораздо сложнее, чем нужно: напомним, что из всего каскада собственно желированием занимается только одна реакция, а все остальные нужны для какой-то непонятной регуляции.

Именно поэтому сейчас исследователи — коагулологи, работающие в самых разных областях, от клинической гемостазиологии до математической биофизики, активно переходят от вопроса «Как устроено свертывание?» к вопросам «Почему свертывание устроено именно так?», «Как оно работает?» и, наконец, «Как нам нужно воздействовать на свертывание, чтобы добиться желаемого эффекта?». Первое, что необходимо сделать для ответа, —научиться исследовать свертывание целиком, а не только отдельные реакции.

Как исследовать?
Для изучения свертывания создаются различные модели — экспериментальные и математические. Что именно они позволяют получить?
С одной стороны, кажется, что самое лучшее приближение для изучения объекта —сам объект, в нашем случае —человек или животное. Это позволяет учитывать все факторы, включая ток крови по сосудам, взаимодействие со стенками сосудов и многое другое. Однако тогда сложность задачи окажется почти бесконечной. Модели свертывания позволяют упростить объект исследования, не упуская его существенных особенностей.

Попытаемся представить, каким требованиям должны отвечать эти модели, чтобы корректно отражать процесс свертывания in vivo.

В экспериментальной модели необходимо учитывать все биохимические реакции, происходящие в организме. Должны присутствовать не только белки системы свертывания, но и прочие участники этого процесса —клетки крови, эндотелия и субэндотелия. Система должна учитывать пространственную неоднородность свертывания in vivo: активацию от поврежденного участка эндотелия, распространение активных факторов, присутствие тока крови.

Эти требования должны выполняться в достаточной мере, чтобы результаты эксперимента могли быть с должными оговорками применимы к организму. Упрощение не повод для отказа от использования метода, но накладывает ограничения на применимость получаемых результатов. Как видно, вопрос выбора модели чрезвычайно важен, так как от этого напрямую будут зависеть полученные с ее помощью результаты. Как же при таком «упрощении» не упустить суть и получить ответы на интересующие нас вопросы? Для этого в исследовании используется не одна, а несколько моделей, а вывод в конечном счете проверяется на живом организме.

Рассмотрение моделей свертывания естественно начать с методов изучения свертывания in vivo. Основа практически всех используемых подходов такого рода заключается в нанесении подопытному животному контролируемого повреждения с тем, чтобы вызвать гемостатическую (кровотечение) или тромботическую (формирование в сосуде сгустка, мешающего нормальному кровоснабжению) реакцию. Существует много способов исследования данной реакции: наблюдение за временем кровотечения; анализ плазмы, взятой у животного; вскрытие умерщвленного животного и гистологическое исследование; слежение за тромбом в реальном времени с использованием микроскопии или ядерного магнитного резонанса.

Классическая постановка эксперимента по свертыванию in vitro заключается в том, что плазма крови (или кровь) смешивается в некоторой емкости с активатором, после чего анализируется процесс свертывания. Для этого разработаны экспериментальные методики, которые можно разделить на два типа: наблюдение за самим процессом свертывания или за изменением концентраций факторов свертывания по времени. Второй подход дает несравненно больше информации. Теоретически, зная концентрации всех факторов во все времена, можно получить полную информацию о системе. На практике одновременное исследование даже двух белков стоит дорого и связано с большими техническими трудностями.

Наконец, свертывание в организме протекает неоднородно. Формирование сгустка запускается на поврежденной стенке, распространяется с участием активированных тромбоцитов в объеме плазмы, останавливается с помощью эндотелия сосудов. Адекватно изучить эти процессы с помощью классических методов невозможно. А ведь надо еще учесть наличие потока крови в сосудах.

Осознание этих проблем привело к появлению в 1970 — х годах разнообразных проточных экспериментальных систем in vitro. Несколько больше времени потребовалось на понимание пространственных аспектов проблемы. Только в 1990 — х годах начали создаваться методы, учитывающие пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания, и только в последнее десятилетие их стали активно использовать в научных лабораториях.

Наряду с экспериментальными подходами для исследований гемостаза и тромбоза также разрабатываются математические модели (этот метод исследований принято называть «in silico»). Математическое моделирование в биологии позволяет устанавливать глубокие и сложные взаимосвязи между биологической теорией и опытом.

Проведение эксперимента имеет определенные границы и сопряжено с рядом трудностей. Кроме того, некоторые теоретически возможные эксперименты неосуществимы или запредельно дороги вследствие ограничений экспериментальной техники. Моделирование упрощает проведение экспериментов, так как можно заранее подобрать необходимые условия для экспериментов in vitro и in vivo, при которых интересующий эффект будет наблюдаем.

Как работает?

Сделаем следующий логический шаг — попробуем ответить на вопрос: а как система свертывания работает?

Каскадное устройство системы. Начнем с каскада —цепочки активирующих друг друга ферментов. Один из них, работающий с постоянной скоростью, дает линейную зависимость концентрации продукта от времени. У каскада из N ферментов эта зависимость будет иметь вид tN, где t —время. Для эффективной работы системы важно, чтобы ответ носил именно такой, «взрывной» характер: это может привести к минимизации времени, когда сгусток фибрина еще непрочен.

Запуск свертывания и роль положительных обратных связей. Как упоминалось в первой части статьи, многие реакции свертывания медленны. Так, факторы IXa и Xa сами по себе —очень «плохие» ферменты и для эффективного функционирования нуждаются в кофакторах —факторах VIIIa и Va соответственно. Эти кофакторы активируются тромбином: такое устройство, когда фермент запускает собственное производство, называется петлей положительной обратной связи.

Мы предположили, а затем и экспериментально доказали, что положительная обратная связь активации фактора V тромбином формирует порог по активации, и это —свойство системы не реагировать на малую активацию, но быстро срабатывать при появлении большой. Подобное умение переключаться представляется весьма ценным для свертывания: это позволяет предотвратить «ложное срабатывание» системы.

Роль внутреннего пути в пространственной динамике свертывания. Одной из интригующих загадок, преследовавших биохимиков на протяжении многих лет после открытия основных белков свертывания, была роль фактора XI в гемостазе. Его дефицит обнаруживался в простейших тестах свертывания, увеличивая время, необходимое для образования сгустка, однако, в отличие от дефицита фактора XI, не сопровождался нарушениями свертывания.

Один из наиболее правдоподобных вариантов разгадки роли внутреннего пути был предложен нами с помощью пространственно неоднородных экспериментальных систем. Было обнаружено, что положительные обратные связи имеют большое значение именно для распространения свертывания. Эффективная активация фактора X внешней теназой на активаторе не поможет вдали от него сформировать сгусток, так как фактор Xa быстро ингибируется в плазме и не может далеко отойти от активатора. Зато фактор IXa, который ингибируется на порядок медленнее, вполне на это способен (и ему помогает фактор VIIIa, который активируется тромбином). А там, куда сложно дойти и ему, начинает работать фактор XI, также активированный тромбином. Таким образом, наличие петель положительных обратных связей помогает создать трехмерную структуру сгустка.

Путь протеина С как возможный механизм локализации тромбообразования. Активация протеина С тромбином сама по себе медленна, но резко ускоряется при связывании тромбина с трансмембранным белком тромбомодулином, который вырабатывают клетки эндотелия. Активированный протеин С способен разрушать факторы Va и VIIIa, на порядки замедляя работу системы свертывания. Ключом к пониманию роли данной реакции стали пространственно неоднородные экспериментальные подходы. Наши опыты позволили предположить, что она останавливает разрастание тромба.

В последние годы сложность системы свертывания постепенно становится менее загадочной.

Открытие всех существенных компонентов системы, разработка математических моделей, использование новых экспериментальных подходов позволили приоткрыть завесу тайны. Структура каскада свертывания постепенно поддается расшифровке, и сейчас практически для каждой существенной части системы выявлена или хотя бы предложена роль, которую она играет в регуляции всего процесса.

Все эти результаты позволили пересмотреть классическую схему структуры системы свертывания и предложить более современную, где отражена роль отдельных реакций свертывания в функционировании всей системы. Не все в этой схеме можно считать надежно установленным. Например, наше теоретическое предсказание, что активация фактора VII фактором Xa позволяет свертыванию пороговым образом отвечать на скорость потока, пока еще не проверено в эксперименте.
Возможно, что эта картина еще не вполне полна. Тем не менее прогресс в этой области в последние годы вселяет надежду, что в обозримом будущем оставшиеся неразгаданные участки на схеме свертывания обретут осмысленную физиологическую функцию. И тогда можно будет говорить о рождении новой концепции свертывания крови, пришедшей на смену старинной каскадной модели, которая хорошо служила медицине на протяжении многих десятилетий.

Как возникла система свертывания крови?
Защитные системы крови начали формироваться вслед за ее появлением у многоклеточных животных свыше миллиарда лет назад, а система свертывания —около 500 млн лет назад, когда позвоночные животные уже обзавелись иммунной системой. Возможно, очередная ее реакция, которая боролась с бактериями путем обволакивания их фибриновым гелем, привела к случайному побочному результату: кровотечение стало прекращаться быстрее. Это позволило увеличивать давление и потоки в кровеносной системе. А улучшение сосудистой системы, т.е. улучшение транспорта всех веществ, открыло новые горизонты развития. Кто знает, не было ли появление свертывания тем преимуществом, которое позволило позвоночным занять свое нынешнее место в биосфере Земли?

К сожалению, существа с промежуточными формами системы свертывания почти все вымерли. Единственное исключение —бесчелюстные рыбы: анализ генома миноги выявил, что у ее системы свертывания гораздо меньше компонентов. У всех же челюстных позвоночных, от рыб до млекопитающих, эти системы похожи. По схожим принципам работают и системы клеточного гемостаза, хотя мелкие, безъядерные тромбоциты характерны только для млекопитающих, а у остальных позвоночных это — большие ядерные клетки.

© Ваш домашний доктор